Extracción de ADN

Objetivo: 

Aislar el material genético (ADN) de un plátano y saliva humana.

Fundamento:

El DNA se encuentra en el interior del núcleo de las células eucariotas rodeado de proteínas (histonas) que lo mantienen unido y compactado. Para poder aislarlo y observarlo se deben deshacer la membrana plasmática y la envoltura nuclear y también se precisa la desnaturalización de las proteínas. A continuación,se explicará qué pasos del procedimiento explicado anteriormente son los encargados de realizar estas funciones y también se aclarará el porqué de cada paso. –

Trituración del plátano: Incrementar el área superficial del plátano ayuda a hacer la superficie de la membrana más fácil de disolver y también permite una absorción más efectiva del calor y de las soluciones que se añadirán. 

Detergente: Las membranas de las células están formadas por dos capas de lípidos con proteínas transmembrana a través de estas. El detergente ayuda a romper la bicapa de fosfolípidos de las membranas plasmáticas y la envoltura nuclear. Los lípidos de la membrana se descomponen debido al detergente que deshace las uniones que mantienen la membrana junta. Cuando el detergente se pone en contacto con los lípidos éstos se separan de la membrana rompiéndola. La estructura de los lípidos es similar a la del detergente y eso hace que se combinen, formando una burbuja de detergente y lípidos.

Baño caliente: Este paso se utiliza para liberar el DNA de sus barreras protectoras. La incubación se utiliza para acelerar el proceso de rotura de las membranas y para ayudar a disolver la bicapa de fosfolípidos mediante la desnaturalización de las proteínas de membrana y rotura de los enlaces que mantienen los fosfolípidos unidos. El calor “ablanda” la membrana.

Baño frio: El agua fría ayuda a mantener el DNA intacto durante el proceso de extracción. El enfriamiento de la solución ayuda a prevenir la desnaturalización que podría destruir el DNA si se expusiera al calor de manera prolongada (protege el DNA de enzimas que pueden destruirlo como las DNAasas ya que la refrigeración ralentiza las reacciones enzimáticas).  

Homogeneización continua: Con este procedimiento conseguimos que la temperatura (tanto el calor como el frío) actúe sobre todo el contenido del extracto, y no sólo sobre las partes en contacto con el vaso de precipitados. También se consigue que la solución detergente pueda actuar sobre todo el triturado de plátano. 

Filtración: Este paso permite separar los restos de los tejidos del plátano y de las células que hemos roto en los pasos anteriores. Ese maerial no nos interesa y quedará retenido en el colador (los restos más grandes) o en el filtro (restos más pequeños). El líquido filtrado que conseguimos es el que contiene el DNA libre de la membrana nuclear.

Material

- Plátano 

- Piña

- Fairy (o detergente) 

- Agua destilada 

- Sal 

- Agua 

- Etileno 95º (2 horas en el congelador) 

- Balanza 

- Probeta 

- Barilla agitadora 

- Vaso de precipitados 

- Erlenmeyer 

- Termómetro 

- Colador y filtro 

- Embudo 

- Tubos de ensayo 

- Pipeta Pasteur 

- Batidora

Procedimiento:

1. Trituración del plátano: Con la ayuda de un cuchillo cortamos unos 100 g de plátano y lo troceamos hasta obtener porciones muy pequeñas. Después aplastamos todos los trozos con un tenedor para formar una pasta más o menos homogénea. Depositamos esta pasta en un vaso de precipitados.

2. Preparación de la solución de extracción: Primero pesamos con la balanza 3g de sal. Con una probeta preparamos 100ml de agua destilada y 10ml de Fairy. A continuación, lo mezclamos todo en un erlenmeyer procurando no formar muchas burbujas.

3. Detergente + plátano: Vertemos el detergente en el vaso de precipitados que contiene el plátano y lo mezclamos todo procurando de nuevo no hacer muchas burbujas.

4. Baño caliente: Ponemos agua a calentar y con un termómetro medimos la temperatura hasta que alcance unos 60ºC aproximadamente. Después introducimos el vaso de precipitados con la mezcla y vamos removiendo durante unos 15’ con la ayuda de una barita agitadora. Hay que procurar manetener la temperatura en los 60ºC y no hacer muchas burbujas.

5. Baño frio: Preparamos un recipiente con agua y hielo e introducimos el vaso de precipitados. Lo dejamos en estas condiciones durante 5’ removiendo constantemente.

6. Filtración de la solución: Preparamos un erlenmeyer con un colador encima y vertemos el contenido del vaso de precipitados. A continuaciónpreparamos un embudo con un papel de filtro encima y vertemos la solución obtenida anteriormente recogiendo el líquido en un tubo de ensayo. Este segundo proceso puede tardar unos minutos.

7. Solución + alcohol: Sacamos el alcohol del congelador y preparamos en un tubo de ensayo aproximadamente el mismo volumen de alcohol que de la solución de interés.

8. Observación del DNA: Vertemos muy lentamente el alcohol en el tubo de ensayo con la solución. Al cabo de pocos segundos seremos capaces de observar tres capas bien diferenciadas. Encima de todo estará el alcohol, debajo de todo estarán los restos celulares (membranas, orgánulos) del plátano y los otros componentes de la solución y, en la interfase observaremos una especie de hilos blancos rodeados de burbujas. ¡Eso es el DNA!

Obsevaciones y conclusiones:

 

La mezcla tardó demasiado en pasar por el filtro y fue difícil recoger los “hilitos” del DNA del plátano.

Al microscopio óptico en 10x sólo se ven unos pequeños haces de luz, se trata del DNA de nuestra fruta.

En cuanto a la práctica de la saliva fue imposible ver al microscopio algo, ya que hubo un cúmulo de masa que impedía ver el DNA.